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文(wén)庫是一種強大的工(gōng)具(jù)，用(yòng)于遺傳篩選，或鑒别未知的基因。文(wén)庫可(kě)以通過多(duō)種不同質(zhì)粒制備。在給定的文(wén)庫中(zhōng)，質(zhì)粒具(jù)有(yǒu)相同的主幹，但它們表達或靶向不同的基因。一些文(wén)庫覆蓋了大部分(fēn)基因組，而另一些則局限于某些基因。在cDNA文(wén)庫中(zhōng)，每個質(zhì)粒都有(yǒu)一個獨特的cDNA。在shRNA或gRNA文(wén)庫中(zhōng)，每個質(zhì)粒都包含一個獨特的基因靶向序列，但整個文(wén)庫中(zhōng)每個基因都有(yǒu)多(duō)個靶向序列。編碼文(wén)庫包含具(jù)有(yǒu)獨特的semi-random序列的質(zhì)粒，這些質(zhì)粒可(kě)用(yòng)于血統追蹤或解析一次表達多(duō)個基因的效果等應用(yòng)。

Addgene提供的文(wén)庫是在一個試管中(zhōng)混合多(duō)種質(zhì)粒。如果文(wén)庫被設計成隻覆蓋一小(xiǎo)部分(fēn)基因，那麽文(wén)庫就會很(hěn)小(xiǎo)；但它也可(kě)以很(hěn)大(例如Moffat實驗室的Toronto KnockOut (TKO)文(wén)庫有(yǒu)超過175,000個包含不同gRNA的質(zhì)粒)。

一、gRNA文(wén)庫

gRNA文(wén)庫是通過一段與目标DNA相同的gRNA指導Cas9核酸酶對靶基因進行DNA修飾，以此造成基因功能(néng)突變或缺失。gRNA文(wén)庫是藥物(wù)篩選或靶向篩選特定通路的理(lǐ)想工(gōng)具(jù)，在功能(néng)基因篩選、疾病機制研究及藥物(wù)研發等方面發揮重要的功能(néng)。

二、文(wén)庫的使用(yòng)

一旦您從Addgene收到文(wén)庫後，請查看文(wén)庫信息，看看它是否應該先擴增，然後再進行篩選。如果您需要先擴增文(wén)庫，請參考寄存人提供的方法，以獲得最佳效果。

對于某些文(wén)庫，質(zhì)粒DNA可(kě)以直接遞送到細胞内。而其他(tā)的，特别是集合慢病毒質(zhì)粒的文(wén)庫，必須先用(yòng)于制造病毒。随後，用(yòng)這種混合病毒将質(zhì)粒運送到靶細胞。無論什麽情況，都建議對大規模制備的 DNA進行二代測序，以驗證文(wén)庫的完整性。不完整的文(wén)庫可(kě)能(néng)導緻在以後的實驗中(zhōng)出現假陽性或假陰性，并可(kě)能(néng)對數據的重現性産(chǎn)生負面影響。

三、文(wén)庫篩選分(fēn)類

在文(wén)庫篩選中(zhōng)，細胞以極低的MOI感染，确保每個細胞最多(duō)進入一種質(zhì)粒。為(wèi)了确保每個質(zhì)粒在群體(tǐ)中(zhōng)都得到充分(fēn)的表達，您需要感染比文(wén)庫中(zhōng)質(zhì)粒數量多(duō)得多(duō)的細胞。例如，Moffat實驗室使用(yòng)了高于TKO文(wén)庫中(zhōng)質(zhì)粒數量200倍的細胞。使用(yòng)大量的細胞将可(kě)能(néng)導緻假陽性或陰性結果的影響最小(xiǎo)化。

上圖概述了gRNA庫是如何使用(yòng)的。以下是篩選過程中(zhōng)應采取的一般步驟：

1. 擴增文(wén)庫(電(diàn)穿孔法和大規模制備法)。

例：#gRNA文(wén)庫# 構建的載體(tǐ)數量較少，不足以進行文(wén)庫的慢病毒包裝(zhuāng)和使用(yòng)。因此，需要對載體(tǐ)進行擴增。将gRNA載體(tǐ)構建完成後，我們将這些載體(tǐ)按相同的比例混合成一個pool（即載體(tǐ)混合庫），随後将載體(tǐ)混合庫使用(yòng)專用(yòng)電(diàn)轉感受态，電(diàn)轉擴增培養并收集菌落，并進行擴大培養，最後抽提質(zhì)粒，即得到了擴增後的載體(tǐ)混合庫，也就是文(wén)庫。

2. 如果通過病毒傳遞，則先制造病毒；這就創建了一個慢病毒CRISPR文(wén)庫。

例：擴增後的gRNA文(wén)庫在慢病毒包裝(zhuāng)載體(tǐ)的輔助下轉染293T細胞，進行慢病毒的包裝(zhuāng)。由于gRNA文(wén)庫是由多(duō)個不同的gRNA載體(tǐ)混合而成，因此獲得的慢病毒是混合型病毒庫，每個病毒攜帶單個gRNA載體(tǐ)。

3. 将文(wén)庫遞送到靶細胞。

文(wén)庫篩選可(kě)分(fēn)為(wèi)兩類：正篩和負篩。

正篩：

• 應用(yòng)文(wén)庫

• 應用(yòng)篩選（多(duō)數細胞死亡或未通過篩選（通過報告基因））

• 挑出通過篩選的細胞

• 細胞測序

• 得到通過篩選的基因列表

在正向篩選中(zhōng)，目标是識别那些選擇後存活下來的細胞。選擇壓力必須足夠強，使大多(duō)數細胞死亡，将它們的質(zhì)粒從集合中(zhōng)移除，隻有(yǒu)一小(xiǎo)部分(fēn)細胞存活下來。收集存活的細胞後，對其質(zhì)粒進行PCR擴增并使用(yòng)NGS測序，以鑒定其cDNA或目的基因。正向篩選通常是非常強大的，最初出現的數萬個基因可(kě)能(néng)會縮小(xiǎo)到幾百個或更少。

負篩：

• 應用(yòng)文(wén)庫

• 對對照樣本進行二代測序（無選擇性），平行應用(yòng)文(wén)庫

• 應用(yòng)篩選（多(duō)數細胞存活）

• 對比實驗組和對照組的測序結果

• 得到一個通過篩選而消失的gRNA列表

負篩比正篩要複雜一些。在負向篩選中(zhōng)，目标是識别出那些無法通過選擇機制存活下來的細胞。您将感染兩組細胞，其中(zhōng)一組進行選擇，另一組作(zuò)為(wèi)非選擇的對照。然後使用(yòng)NGS對這兩個群體(tǐ)進行測序，以确定哪些質(zhì)粒已被選擇删除。在CRISPR篩查中(zhōng)，負向篩選通常用(yòng)于識别在特定條件下對生長(cháng)/生存至關重要的基因。

二代測序

二代測序技(jì )術允許在一次反應中(zhōng)同時對數百萬個DNA片段進行平行測序。如上所述，使用(yòng)這種技(jì )術對于執行文(wén)庫篩選是至關重要的。

參考資料：

如需了解相關信息，可(kě)查看網址：http://www.addgene.org/guides/pooled-libraries/

• CRISPR指南，了解更多(duō)關于CRISPR/Cas9全基因組篩選的信息。

• 浏覽病毒載體(tǐ)資源。

• 查看一些最受歡迎的文(wén)庫信息。

使用(yòng)CRISPR/Cas9全基因組篩選

慢病毒CRISPR文(wén)庫使基因組大規模、敲除篩選

集合CRISPR文(wén)庫為(wèi)大規模功能(néng)篩選提供全基因組對照

血統追蹤新(xīn)工(gōng)具(jù)：ClonTracer文(wén)庫

以上部分(fēn)内容來源于Addgene和網絡