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研究背景

1、 新(xīn)生兒真皮黑色素細胞是一個産(chǎn)生色素的細胞；

2、 皮膚色素沉着是一個多(duō)維度且複雜的過程；黑色素，在黑色素細胞中(zhōng)産(chǎn)生，在黑色素小(xiǎo)體(tǐ)中(zhōng)包裝(zhuāng)，随後胞吐到細胞外，接着被相鄰的角質(zhì)細胞内吞。

3、 許多(duō)基因在不同水平上控制着色素沉着和黑色素生成中(zhōng)發揮作(zuò)用(yòng)。

4、 這些基因突變是多(duō)種皮膚疾病的特征，包括色素沉着，色素減退和混合性高/低色素沉着。

5、 此外，周圍其他(tā)固有(yǒu)細胞分(fēn)泌的外部因素也調節着黑色素在黑色素細胞中(zhōng)表達。

6、 人類原代細胞可(kě)以作(zuò)為(wèi)闡明黑色素細胞生物(wù)學(xué)及其對皮膚制劑毒性的有(yǒu)用(yòng)模型。然而，原代細胞有(yǒu)其局限性，例如供體(tǐ)的差異性和有(yǒu)限的壽命。因此，研究者需要一個更強大的人類黑色素細胞模型系統，用(yòng)于研究皮膚色素沉着和影響色素沉着的因素。

解決方案

根據客戶需求開發人永生化新(xīn)生兒皮膚黑色素細胞系：CRL-4064

1、 通過在原代新(xīn)生兒皮膚黑色素細胞（ATCC®PCS-200-012™)中(zhōng)插入過度表達人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）蛋白，建立了人永生化新(xīn)生兒皮膚黑色素細胞系。

2、 這種新(xīn)建立的細胞系，可(kě)以用(yòng)作(zuò)人永生化真皮黑色素細胞系（ATCC®CRL-4059™)體(tǐ)外毒性研究和色素沉着調節的細胞模型的補充。

3、 且該新(xīn)生兒細胞來自于亞裔供體(tǐ)。

産(chǎn)品信息

黑色素細胞标記物(wù)表達

圖1、永生化黑色素細胞均勻表達黑色素細胞特異性标記物(wù)TRP1，不表達成纖維細胞特異性标記物(wù)TE7。用(yòng)4%多(duō)聚甲醛固定hTERT黑色素細胞，然後在PBS中(zhōng)用(yòng)0.2%Triton x-100、0.1%吐溫-20和10%正常山(shān)羊血清溶液做浸潤封閉。然後細胞在含有(yǒu)0.05%吐溫-20 和2%NGS的PBS溶液中(zhōng)，1:400小(xiǎo)鼠抗人的一抗中(zhōng)進行染色。之後對細胞進行洗滌，然後以1:400稀釋的Alexa fluor 488結合的山(shān)羊抗鼠二抗IgG進行染色。最後細胞用(yòng)PBS稀釋的1:5000 Hoechst核染色進行複染，并用(yòng)尼康Ti-eclipse成像倒置顯微鏡和20x物(wù)鏡進行觀察。（比例尺為(wèi)100微米）

細胞形态

圖2、hTERT永生化新(xīn)生兒黑色素細胞形态與典型的黑色素細胞形态類似。用(yòng)高倍和低倍倒置顯微鏡在10倍物(wù)鏡下拍攝貼壁黑色素細胞的融合圖像。（比例尺為(wèi)82微米）

常見問題

Q1、hTERT新(xīn)生兒黑色素細胞系是如何産(chǎn)生的？

答(dá)：CRL-4064是通過逆轉錄病毒轉導産(chǎn)生的。病毒顆粒是通過轉染BABE-puro-hTERT質(zhì)粒導入Phoenix AMPHO（CRL-3213）包裝(zhuāng)細胞産(chǎn)生的。原代細胞被病毒感染後，接受抗生素加壓選擇，并挑選陽性的單細胞克隆。

Q2、永生化是如何确定的？

答(dá)：從兩個方面來看，壽命測試：該細胞系在35個群體(tǐ)倍增後，生長(cháng)率沒有(yǒu)下降，端粒酶也沒有(yǒu)下降，通過TRAP（端粒酶重複擴增方法）檢測活性。與CRL-1573陽性對照組比較，這些細胞顯示出高的 (≥ 8個重複DNA單元）端粒酶活性。

Q3、hTERT新(xīn)生兒黑色素細胞的推薦培養基是什麽？

答(dá)：該細胞系在真皮細胞基礎培養基（PCS-200-030）中(zhōng)與成人黑色素細胞生長(cháng)試劑盒（PCS-200-042）和0.5微克/毫升嘌呤黴素（維持hTERT表達）中(zhōng)生長(cháng)。

Q4：CRL-4064細胞系的主要用(yòng)途是什麽？

答(dá)：CRL-4064旨在替代原代細胞，用(yòng)于毒理(lǐ)學(xué)或藥物(wù)篩選應用(yòng)，以應對原代細胞在培養中(zhōng)的壽命短暫的問題。該細胞也可(kě)用(yòng)于基因調控研究。

Q5、原代黑色素細胞和hTERT黑色素細胞系之間有(yǒu)什麽區(qū)别？

答(dá)：hTERT黑色素細胞繼續分(fēn)裂，超過了典型的Hayflick限制的~15個PDL，在高傳代次數時，它們甚至沒有(yǒu)表現出生長(cháng)停滞。ATCC提供了兩種hTERT永生化黑色素細胞系：CRL-4064為(wèi)新(xīn)生兒供體(tǐ)的，CRL-4059為(wèi)成人供體(tǐ)的。