N

01 研究背景

免疫檢查點抑制劑最近在肺癌、肝癌、乳腺癌、腎癌和皮膚癌的治療中(zhōng)取得了成功。然而，免疫模型的内在複雜性和不同癌症類型之間對藥物(wù)反應的不同，對開發和應用(yòng)這些新(xīn)型的免疫療法提出了挑戰。

為(wèi)了促進這種不斷增長(cháng)的免疫調節劑類的大規模藥物(wù)發現，研究學(xué)者們對ATCC收藏的大量人類腫瘤細胞系和免疫細胞系中(zhōng)已建立和新(xīn)的免疫檢查點分(fēn)子進行了全面的蛋白質(zhì)譜分(fēn)析。

基于這些蛋白質(zhì)分(fēn)析數據，研究學(xué)者們新(xīn)建了HCC827-GAS-Luc2，一種具(jù)有(yǒu)内源性高表達的程序性死亡配體(tǐ)1(PD-L1)的免疫檢查點報告癌細胞系。

該報告細胞系含有(yǒu)一個γ幹擾素激活位點(GAS)---熒光素酶基因上遊的應答(dá)元件。當癌細胞上的PD-L1與T細胞上的程序性死亡受體(tǐ)-1(PD-1)結合時，熒光素酶的表達被抑制。在PD-1/PD-L1抑制劑的存在下，HCC827-GAS-Luc2細胞産(chǎn)生基于熒光素酶表達的生物(wù)發光信号，該信号可(kě)以很(hěn)容易地被檢測和量化，以評估該抑制劑的效能(néng)、效力和動力學(xué)數據。

02 解決思路

癌症免疫治療已成為(wèi)許多(duō)造血惡性腫瘤的有(yǒu)效治療方法，特别是PD1/PD-L1和CTLA-4阻斷療法。然而，在實體(tǐ)腫瘤中(zhōng)，該療法成功率明顯較低。

最近的研究表明，在體(tǐ)外和體(tǐ)内，幹擾素γ受體(tǐ)(IFN-γR) JAK-STAT信号通路在實體(tǐ)腫瘤中(zhōng)是T細胞殺死癌細胞所必需的，而在液體(tǐ)腫瘤中(zhōng)非必須。同時，熒光素酶基因上遊含有(yǒu)一個γ幹擾素激活位點(GAS) 應答(dá)元件的細胞信号報告系統(如螢火蟲熒光素酶；Luc2)被廣泛用(yòng)于檢測細胞間IFN-γ信号。

圖 1: 作(zuò)用(yòng)機理(lǐ)。通過PD-L1阻斷T細胞活性，HCC827-GAS-Luc2細胞産(chǎn)生熒光素酶信号。Created with BioRender.com。

因此，研究學(xué)者利用(yòng)已證明的 IFN-γ-IFN-γR JAK-STAT GAS-Luc2報告系統來構建一個實體(tǐ)腫瘤細胞系，該細胞系能(néng)夠穩定地報告活化的CD8+細胞毒性T細胞在殺傷實體(tǐ)腫瘤細胞過程中(zhōng)IFN-γ的活性(圖1)。

為(wèi)了構建這種可(kě)靠的實體(tǐ)腫瘤細胞和細胞毒性T細胞的報告試驗系統，以促進癌症免疫治療藥物(wù)的篩選，研究學(xué)者對ATCC提供的50多(duō)個腫瘤細胞株進行了基于流式細胞術的檢查點蛋白譜分(fēn)析(數據未顯示)。

基于蛋白質(zhì)組學(xué)結果，HCC827細胞系(ATCC® CRL-2868™)因其高内源性表達PD-L1免疫檢查點抑制劑而被選擇。

03 新(xīn)産(chǎn)品的誕生

04 實驗數據

圖 2: HCC827-GAS-Luc2細胞系評估。用(yòng)不同的刺激劑評估HCC827-GAS-Luc2細胞信号激活後熒光素酶表達量：(A)IFN-γ刺激(0.01-1000 ng/mL)，(B) 來着未激活和激活的原代CD8+毒性T細胞的條件性檢查點培養基，(C, D)在PD-L1阻斷抗體(tǐ)或同型對照IgG1(1-1000 ng/mL)的存在下與原代人CD8+毒性T細胞共培養。所有(yǒu)實驗中(zhōng)N=3., P<0.05。

圖3：光鏡下親代HCC827和HCC827-GAS-Luc2的細胞形态。将細胞保持在ATCC推薦的培養條件下，在顯微鏡下觀察細胞形态，并用(yòng)數碼相機拍攝圖像。

05 結論

基于全面的蛋白質(zhì)組學(xué)數據，研究學(xué)者選擇HCC827---天然高表達PD-L1的實體(tǐ)腫瘤細胞系來開發IFN-γ-IFN-γR JAK-STAT GAS-Luc2報告系統(HCC827-GAS-Luc2細胞系)，該系統能(néng)夠可(kě)靠地報告活化的原代人CD8+細胞毒性T細胞在殺死癌細胞時IFN-γ活性。

這種強大的體(tǐ)外免疫檢查點阻斷藥物(wù)測試報告系統是時間依賴和細胞數量相關的，因為(wèi)随着時間的推移，CD8+細胞毒性T細胞逐漸殺死所有(yǒu)這些癌細胞，如果有(yǒu)更多(duō)的細胞毒性T細胞存在，則可(kě)以以更快的速度殺死這些癌細胞。

與市場上其他(tā)使用(yòng)特定免疫檢查點分(fēn)子異位過度表達的工(gōng)程癌細胞系的免疫檢查點分(fēn)析相比,我們新(xīn)的免疫檢查點試驗報告系統更具(jù)有(yǒu)生理(lǐ)相關性，因為(wèi)其自然高表達相關免疫檢查點分(fēn)子。

為(wèi)了最大限度地評估該體(tǐ)系的通用(yòng)性，研究學(xué)者将IFN-γ-IFN-γR JAK-STAT GAS-Luc2報告系統加入多(duō)種癌細胞中(zhōng)，因此用(yòng)戶可(kě)以在整個共培養檢測中(zhōng)使用(yòng)多(duō)種人免疫細胞和對應的癌細胞。例如，可(kě)以使用(yòng)單細胞測序(scRNAseq)新(xīn)定義的T細胞，CAR-T細胞，B細胞和髓細胞。 

此外，這些細胞可(kě)以與其他(tā)人類腫瘤微環境細胞(如原代人類成纖維細胞和内皮細胞)結合使用(yòng)，以便更好地模拟在實體(tǐ)腫瘤微環境中(zhōng)T細胞介導的癌症殺傷事件。所有(yǒu)這些細胞組合都是對市場上其他(tā)免疫檢查點試驗的改進，市場上的信号報告系統僅限于非細胞毒性T細胞株，例如具(jù)有(yǒu)NFAT-Luc2報告的CD4+ Jurkat T細胞株。

最後，考慮到最近的研究表明IFN-γ-IFN-γR JAK-STAT信号在T細胞介導殺傷實體(tǐ)瘤的癌細胞中(zhōng)的重要性，鑒于現在的實體(tǐ)瘤免疫檢查點阻斷治療的成功率明顯偏低，ATCC人癌症GAS-Luc2報告系統更好地支持了免疫檢查點藥物(wù)的發現和開發。

由于ATCC HCC827-GAS-Luc2報告細胞系具(jù)有(yǒu)較高的内源性靶标表達、較強的生物(wù)熒光信号和檢測活性，是檢測候選PD-1/PD-L1信号檢查點阻滞劑的理(lǐ)想細胞系。