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在細胞世界，細胞通過冰凍完成了不變和永恒。今天我們就一起來看看ATCC官方的《動物(wù)細胞培養指南》中(zhōng)關于凍存那些事。

低溫儲存綜述

随着細胞被冷凍至冰點以下，懸液中(zhōng)冰晶和溶質(zhì)的濃度有(yǒu)所增加。如果冷卻過程中(zhōng)，胞内水分(fēn)可(kě)以滲出細胞，則可(kě)以減少胞内冰晶。通常1℃/min的降溫速度可(kě)以促進此過程。但是，水分(fēn)的喪失會導緻細胞收縮，當這種收縮達到一定程度，又(yòu)會導緻細胞活性的劇烈下降。冷凍保護劑，如甘油或者二甲基亞砜（DMSO），可(kě)以緩解這種效應。細胞凍存的标準程序是在含有(yǒu)冷凍保護劑的培養基中(zhōng)，将細胞緩慢冷凍至–70℃，然後将凍存管轉移到液氮中(zhōng)以保持低于–130℃的環境。

凍存液

5%-10%的甘油和DMSO是最常見的凍存保護劑。雖然DMSO對細胞有(yǒu)毒性，但是與甘油相比，其滲入細胞的速度更快，而且凍存重複性更好（而且細胞複蘇效率更好）。但是，DMSO一方面會導緻某些細胞（如HL-60早幼粒細胞）分(fēn)化，另一方面對某些細胞（如HBE4-E6/E7肺上皮細胞）的毒性也過大。對于這些細胞，則應使用(yòng)甘油。甘油可(kě)以通過高壓蒸汽滅菌，而DMSO隻能(néng)通過過濾除菌。DMSO或者甘油至少應達到試劑級（或者更高級别，如細胞培養級），并且分(fēn)裝(zhuāng)，避光保存。

凍存管

凍存管材質(zhì)分(fēn)為(wèi)兩種：玻璃或者塑料。玻璃管更難操作(zuò)，但更适合珍貴細胞的長(cháng)期保存，而且一旦适當密封，其安(ān)全性也更高。

程序降溫盒

有(yǒu)很(hěn)多(duō)方法可(kě)以實現1℃/min的降溫速度。電(diàn)腦控制的可(kě)編程電(diàn)子降溫系統是最好的方式，可(kě)以精(jīng)确保持降溫速度。這也是ATCC唯一采用(yòng)的方法。但這種設備價格較高，僅當對凍存非常敏感的細胞時才有(yǒu)必要使用(yòng)。

比較經濟的方式是将凍存管放置于凍存盒中(zhōng)，在低于–70℃的冰箱中(zhōng)凍存24小(xiǎo)時。已有(yǒu)一些商(shāng)業化凍存盒産(chǎn)品能(néng)夠非常接近1℃/min的理(lǐ)想降溫速度。或者可(kě)以将凍存管放置于壁厚大約15mm的1L容積的聚苯乙烯盒子中(zhōng)，并填充入紙、棉絨或者泡沫起到隔熱的作(zuò)用(yòng)。

液氮罐凍存

長(cháng)期保藏所需要的超低溫（低于 -130℃）環境，可(kě)以使用(yòng)低溫冰箱，更普遍的方法是保存在液氮罐中(zhōng)。液氮儲存分(fēn)為(wèi)兩種方式：将凍存管完全浸入液氮中(zhōng)或者懸于液氮液面以上的蒸氣中(zhōng)。液體(tǐ)體(tǐ)系需要更多(duō)的液氮，後期維護簡單，但是液氮有(yǒu)可(kě)能(néng)進入密封不嚴的凍存管中(zhōng)，并在細胞複蘇時發生凍存管爆炸。

因此，ATCC強烈建議保存在液氮蒸氣中(zhōng)。液氮蒸氣會在罐内産(chǎn)生一個垂直的溫度梯度。液氮底層為(wèi)-196℃，而上層溫度會受到液氮餘量和液氮罐敞開時長(cháng)的影響。為(wèi)保證儲存安(ān)全，請确保罐中(zhōng)液氮充足，以使上層溫度低于-130℃。所有(yǒu)的儲存系統都應配備溫度報警裝(zhuāng)置。

凍存程序

以下程序适用(yòng)于大多(duō)數細胞，如果必要，可(kě)以适當調整。凍存培養基的配方請參考其細胞說明書。

1.凍存前先檢測細胞是否受到細菌、真菌、支原體(tǐ)和病毒的污染。通常凍存後10-14天才能(néng)得到污染檢測結果，如果确定有(yǒu)污染，應将該細胞銷毀。

2.凍存培養基由完全培養基和5% DMSO（ATCC No. 4-X）組成。由于DMSO的溶解會放熱，所以不能(néng)向細胞懸液中(zhōng)直接加入未稀釋的DMSO。

3.以溫和速度（125g×10 min）離心收集細胞，并以1×10*6-5×10*6活細胞/ml的密度重懸細胞。繼續培養細胞直到複蘇後細胞活性得以确定。

4.在凍存管上标記好細胞名(míng)稱，編号和凍存日期等信息。然後每管加入1-1.8 ml細胞懸液（視凍存管體(tǐ)積）并密封。

5.室溫條件下，将細胞在凍存培養基中(zhōng)平衡15-40 min（勿超）。這段時間中(zhōng)，可(kě)以将細胞懸液等分(fēn)加入凍存管中(zhōng)。40min後，細胞活性可(kě)能(néng)會受到DMSO的影響而下降。

6.将凍存管置于已預冷至4℃的程序降溫盒，并将降溫盒置于-70℃（或更冷）的冰箱中(zhōng)至少24小(xiǎo)時。或者，使用(yòng)已預冷至4℃的可(kě)編程電(diàn)子降溫系統以1℃/min的速度将凍存管降溫至-40℃以下，然後迅速降至-130℃。

7.将凍存管迅速轉移至液氮罐或者-130℃冰箱。通常，冷凍的細胞會以10℃/min的速度升溫，一旦達到-50℃以上，細胞會劇烈受損。

8.記錄凍存位置和過程細節等信息。

9.置于-130℃ 24小(xiǎo)時後，取出一隻凍存管并複蘇，以測定細胞活性和是否污染。

凍存細胞複蘇

應以最快速度融化凍存的細胞溶液，然後迅速與完全培養基混合，并接種到合适的細胞瓶中(zhōng)。雖然單層培養的細胞可(kě)以從多(duō)孔闆中(zhōng)複蘇，但其複蘇狀态和細胞培養瓶并不一緻。

雜交瘤等某些細胞系的完全複蘇時間可(kě)能(néng)需要幾天。在複蘇的第一天，某些雜交瘤細胞活性較差且會産(chǎn)生細胞碎片。複蘇時，多(duō)數細胞都會出現活性下降的現象，并在融化後24小(xiǎo)時達到活性最低值。即使不是全部，這種活性下降的多(duō)數情況可(kě)能(néng)是由凍存過程中(zhōng)壓力變化誘導的凋亡導緻的。在這個時間點後，細胞開始恢複并進入指數生長(cháng)期。

1.準備細胞培養容器（如T-75細胞瓶），加入至少10 ml适當的培養基，并平衡溫度及pH。

2.從液氮罐中(zhōng)取出凍存管，并在37℃（或适合該細胞的溫度）水浴中(zhōng)緩慢搖動至冰晶徹底融化（約2 min），注意解凍過程要迅速。

3.從水浴中(zhōng)取出凍存管，浸泡入或者噴塗酒精(jīng)消毒。後續的操作(zuò)，需在無菌操作(zuò)台中(zhōng)，并保證嚴格無菌。

4.擰開凍存管蓋，将細胞懸液轉移至含有(yǒu)9 ml完全培養基的無菌離心管中(zhōng)。溫和離心(125g×10min)，棄去上清即凍存保護劑，注意不要擾動細胞層，加入1-2 ml完全培養基重懸細胞。緩慢吹打使細胞團變松散（如果細胞成簇生長(cháng)，則不要過分(fēn)吹打）。将細胞懸液轉移至含培養基的容器中(zhōng)充分(fēn)混合。

5.24小(xiǎo)時後，檢測細胞狀态。如果需要，可(kě)以進行傳代。