大家好，我是小(xiǎo)菜雞張三，萬萬沒想到師兄讓我寄幾獨立做 ELISA 了。這個我懂，平時跟着師兄勤學(xué)苦練，拍闆加樣我是有(yǒu)模有(yǒu)樣。

待我左手一個 OD450 nm，右手一個 540，納尼？化學(xué)發光法 ELISA 說明書上怎麽沒有(yǒu) OD 值的要求啊？「少年郎，不是所有(yǒu)的 ELISA 都要測 OD 值喲。」暗中(zhōng)觀察已久的師兄得意揚揚地飄過。

下面是小(xiǎo)博士上課時間

什麽是化學(xué)發光法 ELISA？

酶聯免疫吸附測定法（ELISA）。首先将酶直接标記在抗原或抗體(tǐ)上，再經過抗原與抗體(tǐ)結合形成抗原抗體(tǐ)免疫複合物(wù)。通過不同底物(wù)與酶反應後産(chǎn)生的特定産(chǎn)物(wù)的特性，達到定量檢測特定分(fēn)子的目的。根據底物(wù)及相應産(chǎn)物(wù)的不同，ELISA 可(kě)分(fēn)為(wèi)比色法（Colorimetric）與化學(xué)發光法（Chemiluminescent）兩類。

化學(xué)發光法酶聯免疫分(fēn)析系統（Chemiluminescent ELISA）是在免疫反應結束後，加入酶的發光底物(wù)，産(chǎn)生處于激發态的中(zhōng)間體(tǐ)。之後中(zhōng)間體(tǐ)會發射光子釋放能(néng)量以回到穩定的基态，此發光強度可(kě)由光度計（Luminometer）進行檢測，并利用(yòng)标準曲線(xiàn)計算出被測物(wù)的含量。相比于比色法，化學(xué)發光法具(jù)有(yǒu)更高的靈敏度和更寬的檢測範圍。

常見的化學(xué)發光組合是魯米諾（3-aminophthal hydrazide, Luminol）底物(wù)與辣根過氧化物(wù)酶反應。魯米諾于 1928 年首次被合成為(wèi)化學(xué)發光底物(wù)，該底物(wù)的發光反應需要苛刻的條件，發光暗淡且持續時間短。

之後研究人員發現，加入增強劑的增強型魯米諾反應（圖 1）能(néng)夠長(cháng)時間産(chǎn)生明亮且穩定的發光效果，從而使得其廣泛應用(yòng)于免疫分(fēn)析，目前 R&D Systems® 的 QuantiGlo® 系列及 Novus Biologicals® 的 Chemiluminescent ELISA 均采用(yòng)此原理(lǐ)。

圖 1：增強 luminol/peroxide 底物(wù)用(yòng)于化學(xué)發光檢測

QuantiGlo® ELISA Kit 的基本檢測步驟

第一步：向包被有(yǒu)捕獲抗體(tǐ)的微孔闆中(zhōng)加入樣品或标準品，孵育使分(fēn)析物(wù)與包被的抗體(tǐ)結合，将未結合的其他(tā)分(fēn)子清洗掉。

第二步：加入 HRP 偶聯的抗體(tǐ)（檢測抗體(tǐ)）并與一抗捕獲的分(fēn)析物(wù)結合。未結合的檢測抗體(tǐ)被沖洗掉。

第三步：加入增強的魯米諾底物(wù)，使之與 HRP 反應發光，發光強度與樣品中(zhōng)存在的分(fēn)析物(wù)數量成正比。利用(yòng)微孔闆光度計測量發光強度。

QuantiGlo® 試劑盒檢測參數設置及應用(yòng)舉例

如 QuantiGlo® 試劑盒說明書所列，光度計設定可(kě)以使用(yòng)以下參數或同等參數：1.0 分(fēn)鍾滞後時間、檢測時間 0.5 秒(miǎo)/孔、求和模式、自動增益或同等。

需要注意的是：

相對光單位（Relative light units，RLUs）數值由不同光度計檢測可(kě)能(néng)不同，需要按照儀器制造商(shāng)的建議調整設置。

相對光單位的數值可(kě)能(néng)在 15 分(fēn)鍾的閱讀窗口期間内發生變化，由于需要參考标準曲線(xiàn)數值換算，所以這并不會影響結果。

應用(yòng)舉例 1：Human VEGF QuantiGlo ELISA Kit（貨号 QVE00B）

使用(yòng) MOLECULAR DEVICE 品牌的 SpectraMax® L 微孔闆化學(xué)發光酶标儀進行檢測（SpectraMax® M5/M5e 和 FlexStation® 3 多(duō)功能(néng)酶标儀的化學(xué)發光檢測模式也适用(yòng)）。數據的收集和計算推薦由 SoftMax® Pro 軟件完成，其預設的模闆極大地簡化了相應流程。

實驗步驟及儀器參數設置：

1. 每孔加入 150 μL 實驗稀釋液 RD1-8；

2. 在微孔闆中(zhōng)按 3 複孔形式加入 50 μL 标準品或空白對照（Calibrator 稀釋液）。室溫輕度振蕩（推薦  500 ± 50 rpm）微孔闆 2 小(xiǎo)時；

3. 孵育結束後使用(yòng)排槍吸幹孔内反應液，并用(yòng) 400 μL 洗滌液清洗 4 遍。最後吸幹剩餘洗滌液并在幹淨的吸水紙上拍幹；

4. 每孔加入 200 μL VEGF 複合物(wù)，貼上新(xīn)的粘合帶。室溫輕度振蕩 (推薦 500± 50 rpm) 微孔闆 3 小(xiǎo)時；

5. 按照步驟 3 進行清洗步驟；

6. 每孔加入 100 μL Glo 工(gōng)作(zuò)液，室溫避光孵育 5 至 20 分(fēn)鍾；

7. 用(yòng) SpectraMax® L 微孔闆化學(xué)發光酶标儀測定 RLU 值。相關參數如下：1 秒(miǎo)檢測時間，PMT 自動和 470 nm 目标校準波長(cháng)。

結果：顯示由 SpectraMax® L 微孔闆化學(xué)發光酶标儀按照上述的參數所得的 VEGF 标準曲線(xiàn), 其動态範圍超過 4 個數量級，計算所得的檢測限，也就是空白對照信号标準差 3 倍值的相應量為(wèi) 1.5 pg/mL，與該試劑盒平均檢測下限為(wèi) 3.3 pg/mL 相符。

圖 2，20,000-1.3 pg/mL 的标準品檢測曲線(xiàn)圖。實驗由 SpectraMax® L 微孔闆化學(xué)發光酶标儀按照 1 秒(miǎo)檢測時間，PMT 自動和 470 nm 目标校準波長(cháng)的參數進行讀取。标準曲線(xiàn)由 SoftMax® Pro 軟件繪制。

應用(yòng)舉例 2：Human IL-6 QuantiGlo ELISA Kit（貨号 Q6000） 

使用(yòng) DYNEX TECHNOLOGIES 品牌的 MLX™ 微量滴定光度計測量光的強度，繪制标準曲線(xiàn)，并分(fēn)析結果。由于底物(wù)發光持續時間長(cháng)，所以閱讀窗口期可(kě)以是加入底物(wù)後的 20~40 分(fēn)鍾之間。實驗步驟均嚴格按照試劑盒說明書操作(zuò)。

儀器參數設定：

① 起始模式（Start Mode）：1 分(fēn)鍾滞後時間

② 振蕩及溫度設定：關閉（Off）

③ 檢測選項：

• 自動讀取 (Auto Gain)
• 求和模式 (Sum all Readings)
• 檢測時間 1 秒(miǎo)/孔

軟件操作(zuò)：

① 隻含有(yǒu)校準稀釋液（Calibrator Diluent）的标準品零值孔被定義為(wèi)空白孔（Blank）：
含有(yǒu)其他(tā)不同濃度标準品的孔被定義為(wèi) S1-S5 孔。
含有(yǒu)陽性對照（Control）的孔根據對應标簽使用(yòng)「用(yòng)戶可(kě)定義的類型（User Definable Types）」定義為(wèi) LL、L、M、H。
含有(yǒu)樣本的孔需定義為(wèi)測試品（Tests）。

② 在空白模式窗口中(zhōng)，選擇平均（Average）。将所有(yǒu)空白孔（标準品零值孔）取平均值，其他(tā)孔值将統一減去這個平均值。

③ 在曲線(xiàn)拟合（curve fit）窗口中(zhōng)，輸入 S1-S5 的 IL-6 标準品濃度，并在相對光（Relative Light）窗口使用(yòng) log/log Cubic Spline 模式拟合并繪制曲線(xiàn)。

④ 數據矩陣（Data Matrix）及拟合曲線(xiàn)圖将呈現在測試報告（Test Report）中(zhōng)。

結果：

——「喔，我明白了，師兄選這個盒子是考慮到實驗組間樣本中(zhōng)目标分(fēn)析物(wù)的含量差異大，過多(duō)的稀釋操作(zuò)一方面費時費力，另一方面容易造成誤差對吧，師兄果然厲害！」

——「其實，主要還是因為(wèi)我懶……」

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