當我們曆經種種挑戰獲得實驗結果，經常會發出疑問三連：

• 我的實驗結果是不是準确？
• 我的結果是否出現假陽性或假陰性？
• 結果的差異是不是因實驗設計中(zhōng)的變量造成的？

要回答(dá)這些問題，合适的對照樣品就成了不可(kě)或缺的一環。

一、陰性對照與陽性對照

• Western Blot 實驗結果有(yǒu)雜帶？
• IHC 實驗沒有(yǒu)陽性信号？
• 目的蛋白表達定位與文(wén)獻報道的有(yǒu)出入怎麽辦(bàn)？

要回答(dá)這些問題，就需要在實驗中(zhōng)設置陰性或陽性對照。

陽性對照品一般會使用(yòng)文(wén)獻或數據庫中(zhōng)報道的高表達目的蛋白的組織或細胞。陽性對照确保了實驗的靈敏度，也保證了實驗過程中(zhōng)抗原抗體(tǐ)的結合效率。

陰性對照品一般會使用(yòng)或文(wén)獻或數據庫中(zhōng)報道的低表達目的蛋白的組織或細胞，使用(yòng)敲低或敲除目的基因的樣本。在 IHC/ICC 實驗中(zhōng)，也可(kě)以用(yòng) PBS 或同型對照代替一抗。陰性對照确保了實驗的特異性，排除非特異性信号對結果造成的幹擾。

接下來，我們舉個例子：

比如用(yòng)二乙基亞硝胺誘導小(xiǎo)鼠肝纖維化，常常用(yòng) Alpha-SMA 作(zuò)為(wèi)肝纖維化的标志(zhì)物(wù)。在進行 IHC 實驗時，為(wèi)了保證陽性信号的可(kě)靠性，就需要平行加一個胃或結腸組織的樣本作(zuò)為(wèi)對照。因為(wèi)，Alpha-SMA 會特異性的表達在平滑肌細胞，而黏膜細胞無表達。

圖片來源：W Li et al. Cell Death Dis (2019).

如上圖的所示，胃平滑肌層陽性信号明顯，黏膜層無陽性信号，證明抗體(tǐ)得到的信号是敏感且特異的（Alpha-SMA，貨号 NBP2-33006）。

二、同型對照

這個概念，相信深谙流式細胞技(jì )術的小(xiǎo)夥伴都耳熟能(néng)詳。因為(wèi)抗體(tǐ)本身的特殊功能(néng)，特别是抗體(tǐ) IgG Fc 段與細胞的 Fc 受體(tǐ)結合的能(néng)力，會使實驗結果的非特異性信号加強。

同時，在一些抗體(tǐ)的功能(néng)性實驗，比如中(zhōng)和實驗和封閉實驗中(zhōng)，也會對細胞（尤其是免疫細胞）的生理(lǐ)功能(néng)産(chǎn)生一定的影響，進而導緻實驗結果與預期或文(wén)獻報道不相符。

抗體(tǐ)結構與抗體(tǐ)類型示意圖

這時，同型對照就是必不可(kě)少的工(gōng)具(jù)：

同型對照是陰性對照的一種，是利用(yòng)與實驗抗體(tǐ)同亞型的免疫球蛋白，排除實驗本底信号的工(gōng)具(jù)。廣泛運用(yòng)在免疫組化、免疫熒光、流式細胞術、抗體(tǐ)封閉中(zhōng)和實驗等一些以抗原-抗體(tǐ)結合為(wèi)基礎的實驗中(zhōng)。

同型對照需要選用(yòng)與目标抗體(tǐ)相同種屬來源、相同的免疫球蛋白類型及亞型的抗體(tǐ)。如果是應用(yòng)在流式細胞術，還需要标記相同的熒光素。我們通常建議選用(yòng)來自與特異熒光抗體(tǐ)相同生産(chǎn)廠家的同型對照抗體(tǐ), 因為(wèi)其生産(chǎn)工(gōng)藝、熒光蛋白比值以及标記工(gōng)藝都是相同的。

比如：

用(yòng)  Mouse Anti-Human MICA PE-conjugated Monoclonal Antibody（貨号 FAB1300P）檢測 K562  細胞表面的 MICA，因為(wèi)該抗體(tǐ)的種屬來源是小(xiǎo)鼠，免疫球蛋白是 IgG，亞型是 2B，标記的熒光素是 PE，所以，我們使用(yòng)的同型對照應該是 Mouse IgG2B PE 抗體(tǐ)（貨号 IC0041P）。

如上圖，左邊藍色的峰為(wèi)同型對照，右邊橙色的峰為(wèi) MICA 特異性的 PE 信号峰。有(yǒu)了同型對照，自然就能(néng)分(fēn)辨出合适的陽性熒光強度，為(wèi)之後設門和進一步分(fēn)析打下可(kě)靠的基礎。

設置合适的對照就像給實驗加上一層保險，保證了實驗結果的可(kě)靠性，也為(wèi)後續實驗的優化及 trouble shooting 提供了重要的線(xiàn)索。

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